大鼠5羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒
產(chǎn)品僅供教研使用，用于定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中大鼠5-HT。
使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說(shuō)明書(shū)。僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。
簡(jiǎn)介
5羥色胺（5-HT）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，尤其在大腦皮層質(zhì)及神經(jīng)突觸內(nèi)含量較高，對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)起著重要作用。其
化學(xué)式為C10H12N2O，分子量為176.22。5-HT在腦組織中的濃度較高，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)，其含量及功能異?？赡芘c精神病和偏頭痛等多種疾病的發(fā)病
有關(guān)。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測(cè)物5-HT，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育
后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若
樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量
呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本中5-HT的濃度。
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性
本試劑盒僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。
試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、實(shí)驗(yàn)員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使
用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)果變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)
1. 混合蛋白質(zhì)溶液時(shí)，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨(dú)使用容器。
2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。
3. 當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。
4. 顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線(xiàn)照射。顯色劑應(yīng)從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色。
5. 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。
6. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
7. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
8. 顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
9. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
試劑盒組成及儲(chǔ)存條件
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名稱(chēng) |
規(guī)格（48T） |
規(guī)格（96T） |
備注 |
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預(yù)包被酶標(biāo)板 |
8×6條 |
8×12條 |
2-8℃ |
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標(biāo)準(zhǔn)品 |
1支×100μL |
1支×200μL |
2-8℃ |
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100×生物素化抗體 |
1支×50μL |
1支×100μL |
2-8℃ |
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0100×SA-HRP |
1支×50μL |
1支×100μL |
2-8℃ |
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20×濃縮稀釋液 |
1支×15mL |
1支×25mL |
2-8℃ |
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顯色液A |
1支×3mL |
1支×6mL |
2-8℃ |
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顯色液B |
1支×3mL |
1支×6mL |
2-8℃ |
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終止液 |
1支×3mL |
1支×6mL |
2-8℃ |
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20×濃縮洗滌液 |
1支×15mL |
1支×25mL |
2-8℃ |
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封板膠紙 |
2張 |
2張 |
無(wú) |
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產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) |
1份 |
1份 |
請(qǐng)仔細(xì)閱讀 |
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品處理及要求
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。
細(xì)胞培養(yǎng)上清液：
在1000×g下離心15分鐘去除顆粒，立即進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)上清
液樣品建議預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)）
血清：
使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。
避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
血漿：
使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍
融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗(yàn)證可用于本試驗(yàn)，使用時(shí)應(yīng)自行驗(yàn)證可行性。溶血的樣品不適合用于該測(cè)定。
組織勻漿：
用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一
般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃
勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機(jī)研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，
取上清檢測(cè)。
細(xì)胞裂解液：
貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每
1×106個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提
取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。
其它樣本類(lèi)型：
1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
樣品外觀：
樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
樣品保存：
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避
免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋?zhuān)ɡ纾?mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從120ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至6000pg/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的
1×稀釋液，制備得到1000μL的6000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將6000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2
倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 6000pg/mL、3000pg/mL、1500pg/mL、750pg/mL、375pg/mL、187.5pg/mL、
93.75pg/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類(lèi)推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋?zhuān)ㄈ鐖D所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
備注：如待測(cè)樣本中5-HT濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1. 酶標(biāo)板準(zhǔn)備：確定試驗(yàn)所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標(biāo)條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。
2. 樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品（建議樣本用通用稀釋液最少稀釋1倍上樣，目的是減少基質(zhì)效應(yīng)），蓋上封
板膠紙，37℃避光反應(yīng)1 h。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
3. 抗體孵育：每孔加入100μL生物素化抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1h。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟2中的清洗方式清洗4次。
4. 酶標(biāo)孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)30分鐘，清洗4次，拍干。
5. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
6. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為46.88pg/mL。
線(xiàn)性關(guān)系
分別在選取的4份健康大鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度5-HT，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋?zhuān)u(píng)估線(xiàn)性。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別重組大鼠5-HT。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。